蛋白質印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot，是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。結合化學發光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。

原理如下圖：

但是該技術卻非常依賴經驗的積累，為了給廣大實驗同仁們提供有意義的參考和經驗，小編將提供解決實驗過程中遇到問題的一些辦法，僅供參考。

電泳轉印不成功？

1、轉印時間過短

2、電源條件不適當

轉印開始前核實電流；更換緩沖液或增加電壓設定值；嘗試高電場強度轉??；核實電源最高的電流值。

3、蛋白轉印穿透印跡膜

如果印跡膜功率條件設定太高或轉印時間過長，蛋白會穿過膜并轉印到濾紙上。

4、蛋白轉印方向相反

凝膠/印跡膜三明治結構組裝順序相反或放入相反的電極板間；核實電源線的電極是否接反。

5、檢測系統失靈或靈敏度太低

加入適當的陰、陽性抗原對照試劑以檢測試劑盒的靈敏度。

6、錯誤的電荷質量比

使用更酸或更堿性的緩沖液增加轉印效率；蛋白在它們的等電點附近不能全部轉?。ň彌_液的PH值應該比靶蛋白的等電點低或高2個PH值）

7、蛋白在凝膠中沉淀

在緩沖液加入少量的SDS；消除或降低轉印緩沖液中乙醇的含量

8、緩沖液中的甲醇抑制蛋白洗脫

降低甲醇的含量，通常使用量為20%

9、電源線路故障或電源使用不當

檢查保險絲，檢查電源輸出功率

10、凝膠濃度過高

降低%T(全單體)或%C(交聯體)。使用5%C（甲叉丙烯酰胺交聯劑），可使凝膠孔徑最小。降低凝膠孔徑最小。降低凝膠濃度，增大孔徑，可以提高轉印效率

蛋白印記免疫檢測出現高背景

1、封閉不完全

2、清洗不充分

增加清洗次數、時間以及清洗劑的去污力。

在抗體緩沖液中加入Tween-20會降低非特異結合。

3、印跡膜在底物溶液中放置時間過長

4、電泳或轉印過程中污染

5、凝膠上的蛋白樣品過載或在轉印緩沖液中使用了過多的SDS，蛋白直接穿透印跡膜并在轉印體系中循環而不能結合在印跡膜上

6、一級或二級抗體濃度過高

7、溫育槽被污染

清洗溫育槽或使用一次性溫育槽

中洪WB實驗流程：

①做膠：先制成分離膠和壓縮膠。

②上樣：先做好制膠器平板，先后加入已制成的分離膠和壓縮膠（需要大概十幾分鐘反應十幾，與溫度相關，成反比），之后加梳子（有孔，方便后期加入蛋白）加入蛋白。

③跑電泳：需要三個小時。

④轉膜：把PVDF膜貼在膠上。

⑤封閉：封閉不需要的蛋白。

⑥一抗孵育：用的抗體是特定的，放在搖床上，時間需要一上午。

⑦洗膜：把多余的抗體洗掉，洗三次，每次十分鐘。

⑧二抗孵育：抗體是通用的，只要來源相同即可。

⑨再次洗膜：把多余的抗體洗掉，洗三次，每次十分鐘。

⑩曝光：放在成像儀上面成像。（條帶清晰，直，無氣泡，結果就是好的）

中洪WB實驗操作與結果案例圖